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Entrevista Birthe Avery

A SBTE, por intermédio do Professor Marcelo Nogueira, teve a honra de poder conversar com a Dra. Birthe Avery, uma das pioneiras da Produção in vitro (PIV) de embriões na Dinamarca e no mundo. Nesta agradável entrevista, Avery relata um pouco de sua trajetória profissional, relembra sua visita ao Brasil em 1993, conta como superou as dificuldades encontradas nos primórdios da PIV e compartilha sua experiência na área com preciosas dicas laboratoriais. Leitura essencial para profissionais da área ou qualquer pessoa que aprecie boa ciência.


SBTE: Explique como ocorreu seu contato inicial com a produção in vitro de embriões e com a pesquisa nesta área?

Birthe Avery: Como eu comecei na PIV? Para responder a esta pergunta, é necessário começar com o início, pois certamente eu não vim parar na área da fertilização in vitro sem conhecimento ou experiência na área.


Originalmente eu recebi um treinamento como técnica de laboratório em química clínica em Copenhagen, uma educação que levou 3 anos de formação teórica e prática em temas-chave como química orgânica e inorgânica, química de ácido/base/pH, bioquímica, fisiologia, anatomia, medicina, biologia, química gasométrica do sangue, e a interpretação dos resultados em condições médicas aliado a procedimentos práticos com técnicas de laboratório. Depois disso eu completei mais um ano de formação e tornei-me docente do laboratório, posição esta que exerci por quatro anos, quando então decidi estudar medicina.


Conclui minha graduação em medicina em 1977 e passei os 4 anos seguintes como residente em hospitais em Copenhagen, atuando em setores como radiologia, clínica, neurocirurgia e cirurgia ortopédica. Foi quando tive a oportunidade de ingressar em um cargo de pesquisador na Universidade de Veterinária e Agricultura de Copenhagen, o qual fiquei muito contente em aceitar, visto meu interesse real ser puramente a ciência, e não pacientes. Durante o meu trabalho na universidade eu terminei meu doutorado e, mais tarde, obtive o grau de Doutora em Ciências Veterinárias (DVSC).


SBTE: Quais foram as maiores dificuldades que você encontrou nos primeiros anos de PIV na espécie bovina? Como você conseguiu resolvê-los?


Birthe Avery: Meu primeiro projeto na universidade foi a produção de anticorpos monoclonais HY a fim de usá-lo como controle da razão sexual em animais de produção, com base na suposição de que as células do sexo masculino apresentavam o antígeno HY em suas membranas celulares e as células femininas não. Minhas bases para desenvolver o projeto consistia num vasto conhecimento em patologia, medicina, fisiologia, histologia, imunologia, embriologia, biologia e química, além da experiência prática em técnicas de laboratório. Foi um projeto muito difícil por várias razões, bastando dizer que ele fez de mim uma especialista em cultura de células mais sensíveis, o que foi de grande ajuda quando assumi o laboratório de PIV em 1991 na Universidade de Veterinária e Agricultura de Copenhagen, onde, de fato, eu fui capaz de pular os problemas iniciais do processo e, como tinha superado tantas dificuldades antes, a mudança para a PIV acabou sendo muito fácil.


Minhas dificuldades acerca de 1980 eram muitas e quase me fizeram desistir por inúmeras vezes. Eram fatores comuns para toda cultura de células, tais como incubadoras (temperatura, umidade, variações de temperatura entre as prateleiras superiores e inferiores, contaminações, incubadoras instáveis), qualidade da água, teor de CO2, controle de pH, a falta de um sistema de aferição confiável, escolha dos meios, utensílios de plástico de qualidade, estabilidade de protocolos de imunização, a perda de secreção de anticorpos a partir de hibridomas, antes e após a criopreservação. A produção e cultura de hibridomas foi um processo que durou um mês, e o risco de contaminação, bem como a perda de produção de anticorpos com o tempo, eram constantes durante todo período. A realização da PIV levava apenas 10 dias de cultura do começo ao fim, e isso era um alívio.


A técnica da PIV consiste em três etapas principais: maturação in vitro dos oócitos (MIV), fertilização in vitro dos oócitos (FIV), e cultivo in vitro dos embriões (CIV), durante 1-8 dias após a união dos espermatozoides com os oócitos maturados. As grandes perdas embrionárias ocorrem no estágio embrionário de 8-16 de células, no chamado “bloqueio in vitro”, ou seja, embriões capazes de superar este bloqueio são, comumente, capazes de chegar a blastocistos em bom número. Blastocistos são o ponto final na técnica da PIV, sendo que aqueles deixados no CIV por duas semanas eventualmente irão degenerar e morrer.


Minha transição de “anticorpos monoclonais” para a PIV de embriões bovinos foi, então, bastante fácil; apesar de que o grande desafio no início da PIV era como fazer com que um número suficiente de embriões passasse pelo bloqueio de 8-16 células. Isto foi resolvido através da utilização de células alimentadoras (“feeder cells”), que eram células epiteliais do oviduto bovino, adicionadas ao sistema de cultivo in vitro de embriões. Posteriormente, com o aprimoramento da técnica, com o uso de melhores meios e com a redução da tensão de oxigénio de 20% para 5%, as células de alimentação puderam ser deixadas de lado durante a CIV.


Outro problema frequente foram as contaminações recorrentes, já que era muito difícil manter a esterilidade em um ambiente cheio de animais. Tentamos usar antifúngicos químicos, mas desistimos, pois além de não prevenirem contra os fungos, acabavam afetando a produção de blastocisto nos cultivos não-contaminados. Outro tipo de contaminação bastante comum era o que chamamos de morte negra (“Black Death”), uma contaminação por leveduras que acaba sendo facilmente confundida com células somáticas, apesar do aspecto mais escuro que as células normais. Todas os cultivos contaminados eram descartados, bem como os dados embrionários correspondentes. O controle da temperatura também foi um grande problema. Aliás, quando algo dá errado, sempre devemos pensar na temperatura.


A começar pelo abatedouro, durante a coleta dos ovários, em mãos os ovários ficam, na melhor das hipóteses, entre 30-33oC em recipiente térmico. Durante a lavagem dos ovários, aspiração, lavagem e processamento dos oócitos e na manipulação embrionária a mesma temperatura é utilizada, até a passagem para incubadora a 38,5-38,8oC, evitando assim muitas flutuações de temperatura. Nas incubadoras antigas era normal existir uma variação de temperatura de cerca de 0,8oC entre as prateleiras superiores e inferiores, o que não ocorre hoje nos novos equipamentos. Apesar de 0,8oC não parecer muito, esta variação afeta sobremaneira a PIV bovina . A umidade também é de grande importância. Normalmente se atinge humidade total com um recipiente de água na base da incubadora, no entanto isto aumenta o risco de contaminação por fungos, o que pode ser amenizado colocando-se uma moeda ou fios de cobre na água. Mesmo com umidade total, sem uma camada superior de óleo nas placas de cultivo é inevitável que ocorra alguma evaporação de meio, o que altera a osmolaridade do meio. Este revestimento de óleo não têm muita aplicação prática para cultivos de volumes entre 0,5 e 1,0 mL por um período de até 24 horas, no entanto, para pequenos volumes, como gotas, e por longos períodos, a superfície deve ser coberta com óleo para prevenir evaporação.


Sempre que a porta da incubadora é aberta, a temperatura e atmosfera são afetados causando um efeito negativo sobre o desenvolvimento de oócitos ou embriões, uma vez que leva tempo para que o equilíbrio gás/temperatura seja restabelecido. Isto também era um grande problema dos equipamentos antigos. Outra "falha" comum consiste em retirar demasiadamente os embriões da incubadora para verificar seu desenvolvimento. Eles não devem ser perturbados. Com novos equipamentos, no entanto, é possível avaliar o seu desenvolvimento em tempo real com a tecnologia time-lapse, deixando-os fisicamente intocados durante o período de desenvolvimento.


Inicialmente, a aspiração folicular era feita com uma agulha hipodérmica acoplada a uma seringa. Mas este processo era lento, cansativo e pouco eficiente. Em seguida, um sistema de bomba à vácuo foi desenvolvido, mas como os oócitos tinham que se deslocar através de longos tubos, grande parte das células do cumulus se desprendiam devido a turbulência. Finalmente, o sistema de bomba foi aperfeiçoado e a agulha hipodérmica passou a ser montada diretamente sobre o tubo de aspiração.


As taxas de blastocistos dependem dos oócitos obtidos, da maturação dos mesmos, da fecundação, do cultivo embrionário e, obviamente, do sêmen. É fato, também, que o meio desempenha um papel crucial em todos os processos da PIV. Se no início do processo se utilizar oócitos de má qualidade e meios de aspiração deficitários, consequentemente o resultado final será afetado. Os oócitos bovinos aspirados encontram-se na prófase da primeira divisão meiótica, no estágio de vesícula germinativa (GV). Enquanto mantidos no fluido folicular eles permanecem no estágio de GV. Após retirados do ambiente folicular para seguirem para o meio de MIV eles entram em maturação nuclear (retomada da meiose) e após 24 horas praticamente todos já atingiram o estágio de MII (metáfase-2) estando, portanto, prontos para a fertilização. A retomada da meiose in vitro é muito fácil para o oócito, no entanto, é insuficiente para garantir o desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto, visto que a maturação citoplasmática também deve ocorrer apropriadamente. A maturação nuclear pode ser visualizada microscopicamente, mas a maturação citoplasmática só conseguimos avaliar indiretamente com as taxas de blastocisto. A maturação nuclear ocorre em oócitos estando eles com ou sem células do cumulus, enquanto que a maturação citoplasmática requer íntima interação entre cumulus e citoplasma.


Ao longo dos anos eu testei vários meios visando otimizar a MIV. Por fim acabei ficando com um meio de MIV contendo baixa glicose, alta concentração de bicarbonato, gonadotrofinas e 5% de soro. Notei também que a presença de etanol e DMSO, mesmo em pequenas quantidades durante a MIV, prejudicava a maturação citoplasmática, mas não a nuclear, resultando em menores taxas de blastocisto.


Da mesma forma, a tecnologia de FIV foi também otimizada com o tempo. Eu não tive muita sorte usando Percoll para separação espermática, e, no final, cheguei à conclusão de que se tratava de um passo desnecessário e caro. Em alguns lotes, mesmo o breve contato do esperma com o Percoll mostrou-se prejudicial, reduzindo drasticamente as taxas de blastocisto. No final, meu protocolo definitivo foi muito simples, já que eu apenas lavava o sêmen em um meio não-capacitante e depois co-cultivava os espermatozoides com oócitos em meio FIV-Talp capacitante.


Para o CIV vimos que o SOF modificado com 5% de soro e sem células alimentadoras funcionou muito bem em tensão de 5% O2 e 5% CO2. Vimos também que uma vez passado o bloqueio de 8-16 células os embriões podem ser cultivados com sucesso tanto em tensões baixas (5%) quanto elevadas (20%) de oxigénio.


Minha sucessora, Dra. Strøbech otimizou e desenvolveu meios para PIV e hoje os comercializa como meios prontos para uso e livres de soro, sendo ao todo nove produtos. Eu faço parte do conselho de consultoria científica na EmbryoTrans Biotech e considero o portfólio de meios prontos para uso livres de soro, juntamente com meu protocolo otimizado e modificado, uma solução das mais acessíveis para PIV de embriões bovinos. Outros laboratórios podem implementar a técnica sem os problemas da necessidade de manufaturar os meios ou de haver variações nos lotes e ainda utilizando um protocolo mais simples, em prol de resultados mais satisfatórios.


Para ilustrar, hoje em dia conseguimos com o sistema BO-media combinado ao protocolo, altas e consistentes taxas de blastocisto, até 50%. Considerando que a técnica é aplicada em oócitos vindos de abatedouro, com animais de diferentes idades, origens e condições de saúde, estes resultados devem ser considerados excepcionais.


Para produzir blastocistos, tanto os oócitos quanto os espermatozoides são igualmente importantes, embora maior ênfase pareça ser conferido ao oócito. Tivemos a sorte de ter acesso ao laboratório de andrologia do nosso departamento durante os últimos anos. Nem todos os touros produzem um sêmen eficiente para gerar altas taxas de blastocisto, então nós (e outros) não conseguimos demonstrar uma correlação entre as taxas ineficientes do sêmen e o desempenho de fertilização in vitro. No entanto, fomos capaz de mostrar que a desnaturação da cromatina dos espermatozoides correlacionava-se negativamente às taxas de blastocisto in vitro. Nós também testamos uma série de touros após a indução de reação acrossômica dos espermatozoides, e encontramos uma forte correlação positiva com as taxas de blastocisto. Entretanto, na prática, o sêmen de touro para a nossa PIV foi escolhida por seu desempenho in vitro, e não por testes de cromatina ou acrossômos.


A taxa de blastocisto sozinha não é um indicador preciso de qualidade, a menos que a morfologia e a velocidade de desenvolvimento (cinética) estejam incluídas também. Eu desenvolvi um sistema de classificação arbitrária que nos permitiu distinguir entre os sistemas de cultivo com base nas taxas de blastocisto, na média morfológica e na média cinética. Quanto à morfologia atribui-se a classificação de blastocisto (BL, escore 1), BL expandido (escore 2), BL eclodido (escore 3) e a cinética distinguimos como pobre (escore 1), boa (escore 2) e excelente (escore 3). Calculamos o escore considerando %BL x Média morfológica x Média cinética, e o grupo com a maior pontuação é, então, considerado o melhor.


A pontuação é arbitrária e só pode ser usada para comparar os grupos experimentais dentro de uma mesma rodada, porém, esta classificação acabou se tornando um indicador muito útil para comparação da nossa média de produção.


Eu me aposentei há 7 anos, mas permaneci no negócio. Só para constar, fui primeiramente contratada pela MediCult, um centro de pesquisa dirigido pela Dra. Strøbech, na Dinamarca, para um serviço de consultoria para o estabelecimento de um laboratório de fertilização in vitro de bovinos, e para otimizar o desenvolvimento de meios para reprodução humana e outros produtos do setor. Hoje estou no conselho de consultoria científica da EmbryoTrans Biotech dando suporte sobre formulações de meios, protocolos e implementações em meu antigo laboratório de PIV na universidade, agora dirigido pela Dra. Strøbech.


SBTE: Como você compara as três últimas décadas de PIV? Houve uma verdadeira melhoria ou a real mudança ainda está por vir?


Birthe Avery: A PIV com oócitos oriundos de abatedouro é uma poderosa ferramenta da ciência que já nos proporcionou o conhecimento de importantes aspectos da maturação oocitária, do processo de interação oócito-espermatozoide e da capacidade de desenvolvimento do oócito fertilizado até o estágio de blastocisto. Também é útil para a tecnologia de células-tronco embrionárias, bem como para avaliar a normalidade da prole, já que oócitos vindos de abatedouro quase não têm valor na transferência de embriões (TE) comercial, onde a identidade dos oócitos e espermatozoides é necessária. Na PIV padrão o cultivo de grandes quantidades é a regra, enquanto que na aspiração folicular guiada por ultrassom (ovum pick up, OPU) poucos oócitos são processados e mantidos separadamente.


Assim como os sistemas de cultivo, os procedimentos in vitro diferem dos in vivo de inúmeras maneiras. A diferença mais visível consiste nos maiores volumes de meio utilizado e de espermatozoides circundando os oócitos, nas condições estáticas, quando comparadas ao dinamismo que ocorre no processo in vivo. Muitas alternativas vem sendo realizadas para tentar mimetizar as condições in vivo, por exemplo o uso de dispositivos microfluídicos, mas até agora sem muita eficácia, principalmente devido às limitações técnicas. Ensaios para a criação do melhor meio de cultivo, reproduzindo as composições de fluído do oviduto, também são realizados o tempo todo.


SBTE: Quais memórias você têm de sua visita ao Brasil em 1993, na cidade de Jaboticabal?


Birthe Avery: Eu conheci o professor Enoch Borges de Oliveira Filho em uma conferência em Copenhagen no início dos anos 1990, ocasião em que ele visitou meu laboratório e conversamos muito sobre fertilização in vitro. Ele me convidou para uma visita de três meses a seu laboratório e também para participar da conferência da SBTE em 1993. Eu me recordo dele com muito apreço, pois ele foi extremamente agradável e acolhedor para comigo. Eu tive uma ótima estadia em Jaboticabal. Eu conheci muitas coisas e me lembro, particularmente, de uma visita a uma grande central de touros, e também que fiquei muito impressionada com o gado Bos indicus. Na minha opinião, Enoch era um visionário e já compreendia a importância das cooperações internacionais, o que ainda está acontecendo hoje, 20 anos depois, com o projeto GIFT (Genomic Improvement of Fertilization Traits in Dansih and Brazilian Cattle) um projeto de pesquisa com colaboração entre Dinamarca e Brasil.


No laboratório de Enoch eles já realizavam a Produção in vitro de bovinos, e lá conheci suas brilhantes estudantes/cientistas, todas mulheres: Yeda F. Watanabe, Daniela Quetglas, Lia de Alencar Coelho e Christina, naquele momento. Em seguida eu também conheci Claudia Lima Verde Leal, Marcelo Nogueira entre outros. Eles me trataram muito bem durante minha estadia e eu tive o prazer de convidar Daniela ao meu laboratório, em 1995, onde ela passou três meses fazendo fertilização in vitro. Isso tudo enfatiza a importância da participação em congressos e das visitas internacionais para fins científicos frutíferos. Para uma cidadã dinamarquesa vinda de um pequeno país com apenas 5 milhões de habitantes, Jaboticabal não era uma cidade pequena e tudo parecia muito exótico, desde a terra vermelha nas estradas, às bananeiras, os churrascos ao ar livre, aos longos dias de sol, até o jacaré em um lago próximo.


SBTE: Hoje em dia o que você considera ser o “gargalo” da técnica?


Birthe Avery: A limitação da técnica depende da disponibilidade de oócitos tanto de abatedouro quanto os provenientes de animais vivos. Depende também do acesso a um laboratório de FIV confiável, de preferência gerenciado pelas mesmas e dedicadas pessoas com uma base sólida, suprido com aparelhagem estável e confiável, incluindo a possibilidade de documentação fotográfica online e acesso a nitrogênio líquido. O financiamento é igualmente importante, uma vez que  esta biotecnologia requer uso intensivo dos recursos. Está implícito que a esterilidade é crucial.

Em resumo, os fundamentos devem estar em ordem para ter sucesso com a PIV. Isso significa que é necessário ser meticuloso e ter controle sobre todos os detalhes em todos os momentos. É ótimo também se as mesmas pessoas executarem os experimentos todas as vezes. No nosso caso sou eu quem avalia todos os oócitos e embriões. É importante dispor-se de um sistema para elaborar um desenho experimental confiável. A melhor configuração é um desenho fatorial AxB, contendo o mesmo número de estruturas (oócitos/embriões) em todos os grupos, no qual um grupo servirá como controle.


Em seguida, deve-se tentar minimizar os prejuízos de instalação, e isso é bem do início mesmo. Os ovários de abatedouro vêm de uma série de animais diferentes, e os oócitos recuperados são todos reunidos em um grande grupo, consistindo em oócitos de animais de diferentes idades, fertilidade, ciclo estral e condições de saúde e, portanto, não necessariamente comparáveis.

Porém, se os oócitos são distribuídos de maneira correta, este prejuízo será mínimo. Se você tiver, p.ex., 400 oócitos e deseja alocá-los em 4 grupos diferentes, devemos distribuir 100 oócitos em cada grupo experimental. No entanto, é errado simplesmente distribuir 100 em cada um dos grupos, porque inconscientemente sempre se selecionará os oócitos morfologicamente melhores em primeiro lugar, o que significa que os 4 grupos não serão representativos. Em vez disso, deve-se distribuir 10 de cada vez em cada um dos grupos, até que complete 100 em cada grupo. E então, o controle e os grupos experimentais devem ser escolhidos de forma aleatória.


Em conclusão, a técnica de fertilização in vitro é um ponto crucial na embriologia experimental. O sistema bovino é especialmente adequado, pois sob certas circunstâncias, gera um rendimento elevado e consistente, e com uma grande extensão que varia de 0% até 50% de blastocistos, enquanto que o sistema de camundongo provê uma janela estreita para aferir qualidade, de 85% a 100% de blastocistos no ensaio-padrão a partir de embriões de 2-células. E o sistema de PIV suíno ainda é tecnicamente complicado e pouco confiável para a produção de taxas elevadas e estáveis de blastocisto. Além disso, há hoje disponível a possibilidade de análises genômicas com a consequente diminuição do intervalo entre gerações para o melhoramento genético em programas bovinos, e o sistema de PIV bovina está diante de uma nova era, podendo entrar em foco novamente, por assim dizer.


(Traduzido por Eduardo M. Razza, Botucatu, 02 de Julho de 2014)


 

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